Microscope confocal ; profondeur de champ ; fluorescence Concours Capes externe 2008

Schéma du microscope confocal. La performance du microscope confocal en profondeur, c'est à dire sa capacité à séparer des détails suivant la direction verticale, est caractérisée par l'étude de la réponse obtenue pour un échantillon horizontal infiniment fin en z=0. On enregistre l'intensité I reçue par le détecteur en fonction de la position z du point de focalisation P sous l'objectif. La figure suivante représente le tracé partiel de I(Z), fonction paire de la variable réduite Z définie par : Z = 8pn/l0 z sin2(½u).     Définir la profondeur de champ d'un instrument d'optique utilisé avec un détecteur ponctuel. La profondeur de champ est la zone de l'espace dans laquelle doit se trouver un objet de petites dimensions afin que son image soit nette. La largeur à mi-hauteur Dz de la courbe représentative de I(z) définit la profondeur de champ du microscope confocal. Calculer pour l0 = 632,8 nm la profondeur de champ obtenue, d'une part, avec l'objectif x10 dans l'air et, d'autre part, avec l'objectif x100 dans l'huile. Comparer avec le microscope optique classique. L'ouverture numérique de l'objectif du microscope est par définition w0=n sin u où n est l'indice du milieu dans lequel plonge l'objectif et u l'angle maximum par rapport à l'axe optique des rayons isus de P arrivant sur l'objectif. Données : nair = 1 ; sin u = w0 = 0,25 ; nhuile= 1,52 ; w0 =1,30 ; sin u =1,30/1,52 =0,855 ; Air : u = 0,253 ; ½ u = 0,126 rad ; sin2(½u) =0,01588 ; Z = 8pn/l0 z sin2(½u) ; Z = 8*3,14/632,8 10-9 *0,01588 z = 6,30 105 z ; z = Z/6,35 105 =1,586 10-6 Z. A mi-hauteur, d'après la figure ci-dessus, DZ= 8 d'où D z = 8*1,586 10-6 =1,27 10-5 m. Huile : u = 1,0255 ; ½ u = 0,5128 rad ; sin2(½u) =0,2407 ; Z = 8pn/l0 z sin2(½u) ; Z = 8*3,14*1,52/632,8 10-9 *0,2407 z = 1,452 107 z ; z = Z/1,29 107 =6,885 10-8 Z. A mi-hauteur, d'après la figure ci-dessus, DZ= 8 d'où D z = 8*6,885 10-8 =5,51 10-7 m. La profondeur de champ d'un microscope classique est de l'ordre de 10-5 m. Avec l'appui d'une construction d'optique géométrique simple ( en remplaçant l'objectif du microscope par une lentille mince équivalente), expliquer pourquoi le détecteur ponctuel enregistre essentiellement des informations venant du point de focalisation P. Le schéma reproduit le faisceau lumineux issu du point objet A et limité par les bords de la lentille ; le capteur reçoit toute la lumière issue de A. L'image D1 du point D n'est pas dans le plan du capteur et la lumière issue de D ne passe pas par l'ouverture du diaphragme ; en conséquence le capteur ne perçoit pas la lumière issue de D. Comment améliorer ce montage afin que le microscope confocal donne accès à une image tridimensionnelle d'un échantillon non opaque ( une bactérie par exemple ). Le système (capteur CCD + diaphragme) étant fixe et centré sur l'axe optique, il est nécessaire de déplacer l'objet pour former successivement toutes les images des points situés entre A et B. Pour cela on utilise une platine porte-échantillon motorisée. Cette platine permet un déplacement dans les trois directions x'x, y'y et z'z (voir figure ci-dessous). On construit alors point par point l'image d'un plan de l'échantillon. Pour cette raison, on appelle cette technique "microscopie à balayage". Par opposition à la microscopie classique, elle nécessite donc un temps d'acquisition correspondant au déplacement point par point de l'échantillon. Il faut donc déplacer l'objet de façon à pouvoir détecter l'image du point D : le point D doit occuper la position du point A afin que D1 occupe la position A1. déplacement suivant z'z en se rapprochant de la lentille et déplacement suivant y'y vers le bas. La microscopie confocale permet ainsi d'acquérir une série d'images des plans en profondeur dans un échantillon transparent et par suite, d'obtenir, grâce à un traitement informatique, des informations sur la structure spatiale de l'échantillon   Fluorescence. Le microscope confocal peut être utilisé pour réaliser ne image d'un échantillon marqué par des fluorophores. Cela permet de réaliser une imagerie sélective dynamique, de tissus vivants par exemple. Les fluorophores sonr des molécules qui absorbent la lumière dans un certain domaine spectral et la réémettent dans un domaine différent ( luminescence). Les profils spectraux en absorption et en émission du fluorophore FITC ( isothiocyanate de fluorescéine) sont donnés ci-dessous : Dans un microscope confocal à fluorescence, le séparateur de faisceau n'est pas une lame semi-réfléchissante mais un séparateur dichroïque : ce dispositif réfléchit, comme un miroir plan, plus ou moins la lumière suivant sa longueur d'onde. Le microscope confocal à fluorescence est techniquement conçu de sorte que l'image de l'échantillon obtenue soit du uniquement à la lumière fluorescente émise par les fluorophores. La luminescence regroupe les effets de fluorescence et de phosphorescence, ce dernier cas se distinguant du premier par l'existence d'un temps de latence long entre l'absorption et l'émission. Citer un xemple d'objet de la vie de tous les jours qui est phosphorescent. Les aiguilles de réveil ou de montres. On considère un microscope confocal utilisé pour observer un échantillon marqué par des fluorophores FITC et équipé d'une lampe à vapeur de mercure pour l'éclairage, dont le spectre est donné ci-dessous : L'objectif du microscope ne transmet que les longueurs d'onde supérieures à 400 nm. Tracer qualitativement l'allure d'un profil spectral de transmission plausible pour le séparateur dichroïque de faisceau. Justifier.   Le profil spectral en émission du fluorophore FITC et compris entre 500 et 600 nm. Un filtre appelé filtre d'excitation, est placé devant la lampe à vapeur de mercure. Compte tenu du profil spectral du FITC , proposer, avec justification, l'allure d'un profil spectral de transmission cohérent pour ce filtre. Le profil spectral en absorption du fluorophore FITC et compris entre 400 et 500 nm. Il faut éliminer la partie 300nm - 400 nm du spectre de la lampe à valeur de mercure.    On place un filtre, appelé filtre d'arrêt, devant le détecteur. On propose deux filtres dont les profils spectraux de transmission sont représentés ci-dessous. Lequel de ces deux filtres vous semble le plus adapté ? La lumière fluorescente est de faible intensité par rapport à la lumière d'ecitation et le séparateur dichroïque laisse passer une faible partie des basses longueurs d'onde. Réponse : filtre 2.   Ce type de microscope permet de visualiser les tissus qui absorbent les fluorophores.

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